Laboratoř molekulární biologie klíšťat
V naší laboratoři se zaměřujeme na molekulární charakterizaci proteinů, které jsou klíčové pro klíšťata (převážně Ixodes ricinus) a čmelíky (Dermanyssus gallinae) při sání krve na hostiteli, nebo hrají důležitou roli v akvizici a přenosu klíšťaty přenášených patogenů. Náš výzkum pokrývá širokou škálu témat od biologie hemu a železa, popisu proteolytického aparátu, systémové a epiteliální imunity k experimentálním nákazám myší, začlenění funkční mikroflóry až po mapování interakcí mezi proteiny a ligandy.
Naše základní experimentální přístupy zahrnují:
i) ex vivo umělé membránové sání pro všechna vývojová stádia klíštěte I. ricinus a čmelíka kuřího
ii) RNA interference v klíšťatech rodu Ixodes a čmelíkovi kuřím
iii) Model přenosu a nákazy myší pro I. ricinus - Borrelia afzelii
iv) Vakcinační studie proti klíšťatům a přenosu borélií (Borrelia spp.) a proti infestaci čmelíkem kuřím
v) Experimentální model v kultuře pro Babesia divergens a zvířecí model pro Babesia microti
vi) Experimentální model v kultuře pro Anaplasma phagocytophilum
vii) Exprese a purifikace rekombinantních proteinů (enzymatická kinetika, vazebné eseje, vakcinační studie)
viii) Imunodetekce proteinů v klíštěcích tkáních za použití konfokálního mikroskopu, TEM a array tomography
Kromě základního výzkumu provádíme také smluvní výzkum nabízející ex vivo membránové sání pro screening akaricidů prostřednictvím orálního podání v krvi a in vivo studie pro hodnocení vakcín proti klíšťatům u malých savců a proti čmelíkům u slepic.
Řešené výzkumné projekty
Imunita klíšťat
Patogeny přenášené krevsajícími vektory musejí být schopny odolat vrozenému obrannému systému svých přenašečů založenému na systému buněčných i humorálních imunitních odpovědí. Na rozdíl od krevsajícího hmyzu, je znalost imunitního systému klíšťat doposud velmi omezená. Doposud bylo popsáno jen malé množství buněčných reakcí (např. fagocytóza) a imunitních molekul (antimikrobiálních peptidů, lysozymů a lektinů), viz přehledný článek (Kopáček et al., 2010). V naší laboratoři jsme původně pracovali s africkým klíšťákem Ornithodoros moubata, u kterého jsme postupně charakterizovali řadu imunitních proteinů: střevní lysozym účinný proti Gram-pozitivním bakteriím (Kopáček et al., 1999; Grunclová et al., 2003), lektin z hemolymfy pojmenovaný DorinM, který zřejmě funguje v rozpoznání patogenů (Kovář et al., 2000 Rego et al., 2006) a zejména univerzální inhibitor proteáz typu alpha2-makroglobulinu, který je přítomen v plazmě (Kopáček et al., 2000; Saravanan et al. 2003). Náš současný výzkum je zaměřený na evropské klíště Ixodes ricinus, které je významným přenašečem klíšťové encefalitidy a Lymské boreliózy. V našem výzkumu používáme přístup reverzí genetiky, který vychází od znalosti příslušných genů k poznání vlastností a funkcí proteinů, které tyto geny kódují. Náš výzkum se opírá o nedávno zveřejněný genom blízce příbuzného klíštěte Ixodes scapularis a metodu studia funkce proteinů pomocí tzv. RNA interference, kdy můžeme cíleně potlačit syntézu jednotlivých proteinů. Pomocí těchto nástrojů se snažíme postupně odhalit a charakterizovat molekuly, které fungují v kaskádě imunitních reakcí blízce podobných savčímu komplementu, který je nejdůležitější a nejkomplexnější složkou vrozené imunity. Bližší poznání vlastností a funkcí jednotlivých molekul zúčastněných v těchto procesech může pomoci potlačit schopnost klíšťat přenášet nebezpečná onemocnění.
Střevo klíštěte, metabolismus železa a trávení krve
Klíšťata jsou přenašeči různorodých virů, bakterií i prvoků, které způsobují závažná onemocnění lidí i domácích zvířat. Jedna z možností, jak ovlivnit fyziologii klíšťat a jejich schopnost přenášet patogeny, je narušit jejich sání a trávení hostitelské krve. Proto jsme se zaměřili na detailní poznání enzymatického aparátu, který je schopen zpracovat vzhledem k váze nenasátého klíštěte až stonásobnou váhu hostitelské krve. Náš výzkum v této oblasti provádíme v úzké spolupráci s laboratoří Dr. Michaela Mareše, ÚOCHB AVČR, Praha a se světově známou laboratoří Profesora Jamese McKerrow a Conora R. Caffrey v Sandlerově Centru pro základní výzkum parazitických onemocnění, Kalifornské univerzity v San Francisku. Naše výzkumná aktivita je zaměřená na výzkum genů a jejich regulace, biochemickou a proteomickou charakterizaci jednotlivých enzymů a imunohistochemickou lokalizaci v klíštěcím střevě. Postupně charakterizujeme nejvýznamnější trávicí proteázy, které jsou zapojeny do hemoglobinolytické kaskády ve střevních buňkách klíštěte Ixodes ricinus (Sojka et al., 2007; Sojka et al., 2008; Horn et al., 2009). Ukázali jsme, že trávení klíšťat je daleko více podobné trávení např. u krevních motolic než u krevsajícího hmyzu. Poznání celkového mechanismu trávení krve a jeho jednotlivých složek slibuje nalezení potenciálních „Achilových pat“ klíštěte, na které bude možné zaměřit vývoj účinných „proti-klíštěcích“ vakcín.
