Laboratoř rybí protistologie (Ivan Fiala)

​Náš výzkum je zaměřen na eukaryotické mikroskopické organizmy napadající ryby, obojživelníky a plazy. Zabýváme se všemi aspekty jejich struktury, biologie, životních cyklů, interakcemi mezi parazity a hostiteli, imunologií, ekologií, fylogenezí a evolucí. Zaměřujeme se zejména na 1. Myxozoa (rybomorky) a 2. améboidní organizmy, ale studujeme též jiné zajímavé mikroorganizmy, např. výtrusovce, mikrosporidie, nálevníky a obrněnky. Ve spolupráci s četnými institucemi z celého světa provádíme výzkum zaměřený na řešení některých ekonomických a medicínských problémů souvisejících s parazity.

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Řešené výzkumné projekty

MYXOZOA

Myxozoa (rybomorky) jsou rozmanitou skupinou živočichů ze skupiny žahavců, u nichž došlo k výrazné redukci velikosti těla jakožto morfologické adaptaci na parazitický způsob života, která jim umožnila mimo jiné osídlit nejrůznější typy vodního prostředí. Myxozoa charakterizuje složitý životní cyklus: hostiteli myxozoí jsou obratlovci (ryby) a bezobratlí (mechovky - Bryozoa, vodní kroužkovci - Polychaeta nebo Oligochaeta). Některé druhy způsobují významné škody v oblasti akvakultury.bV naší laboratoři se zabýváme řadou aspektů problematiky myxozoí:

 

Biologie, fylogeneze a evoluce

Současná taxonomie myxozoí se zakládá především na morfologických znacích a struktuře spor, které se vyvíjejí v obratlovčím hostiteli (ryby). Příbuzenské vztahy mezi jednotlivými druhy myxozoí založené na fylogenetických analýzách vybraných genů ovšem poukazují na rozpor mezi tradičním taxonomickým přístupem a molekulárními daty: u celé řady myxosporeí s velmi podobnou morfologií spor řazených do stejného rodu nebyla zjištěna blízká fylogenetická příbuznost. Většina rodů tedy netvoří monofyletickou skupinu. Ale jakou roli hraje morfotyp spor v evoluci těchto velmi redukovaných parazitů? Jedním z našich hlavních cílů je zkoumat rozdíly s ohledem na vývoj parazita, životní cykly a biologii, abychom byli schopni porozumět, proč se ve fylogenetickém stromu objevují skupiny velmi blízce příbuzných druhů morfologicky zásadně odlišných. To by nám mělo umožnit určit znaky, které formují evoluci myxosporeí a vést k hlubšímu porozumění značné rozmanitosti současných druhů.

Modelový organismus pro výzkum myxozoí

Funkční výzkum myxozoí je velmi obtížný, a proto také mnoho aspektů jejich biologie zůstává stále neodhaleno. Hlavním důvodem je to, že nám stále chybí in vitro modelu a jen omezená možnost in vivo modelů, které by umožnily funkční analýzy. Pouze několik životních cyklů je kontinuálně udržováno ve výzkumných laboratořích po celém světě, protože jejich udržení je obtížné a časově náročné, přičemž k produkce infekčních stadií spor v rybách v kulturách máloštětinatců nebo mnohoštětinatců je zapotřebí několik týdnů nebo měsíců. Nedávno jsme zavedli první kontinuální in vivo model pro pre-sporogonická proliferativní stadia myxozoí (Born-Torrijos et al. 2022, Cells 11: 377). Naším modelem je Sphaerospora molnari, běžný parazit kapra obecného, Cyprinus carpio Eszterbauer et al. 2013, Dis Aquat Org 104:59-57). Během přirozené infekce S. molnari invaduje epitelie kůže a žaber, kde tvoří spory a způsobuje výrazné dystrofické změny a nekrózu. Než dojde k tvorbě spor se S. molnari množí v krvi kaprů a tvoří vysoce pohyblivá krevní stadia (Hartigan et al. 2016, Sci Rep 6:39039).  Náš výzkumný model se zaměřuje na tento raný intrapiscinní vývoj a překonává problémy související s dobou do tvorby spor v bezobratlých hostitelích přenosem krevních stadií z ryby na rybu. Jsme také schopni kultivovat a množit tato stadia po několik dní in vitro. Zároveň máme k dispozici genomická a transkriptomická data pro zkoumání genů parazita a hostitele. Model nám tedy umožňuje zkoumat expresi genů specifických pro stádium, interakce hostitel-parazit, stejně jako identifikaci potenciálních terapeutických cílů (Hartigan et al. 2020, BMC Genomics 21:404; Korytar et al. 2019, Parasit Vect 12:208; Korytar et al. 2020, Parasite Immunol 42:e12683).

Odhalování skryté diverzity a původu myxozoí pomocí eDNA

Myxozoan spore in amongst other plankton organismsVzhledem k mikroskopickým rozměrům, kryptické povaze a střídání hostitelů víme jen velmi málo o skutečné diverzitě myxozoí. V současnosti se věnujeme sekvenační analýze (pomocí sekvenování nové generace, NGS) environmentálních vzorků získaných filtrací mořské a sladké vody a také sedimentů z vodního prostředí po celém světě. Již se nám podařilo tímto přístupem odhalit novou fylogenetickou linii myxozoí. Slibujeme si také, že dosažené výsledky umožní hlubší pochopení evoluce myxozoí a možná pomohou objasnit i otázku mořského či sladkovodního původu myxozoí. Molekulární metody rovněž umožňují studovat a odhalovat nové skupiny hostitelů - obratlovců i bezobratlých, které doposud unikaly pozornosti jako potenciální hostitelé myxozoí.

 

Využívání hostitele myxozoi

Macrophage (green) attachment to blood stage of the myxozoan Sphaerospora molnari (red)S využitím transkriptomických a proteomických analýz kombinovaných s experimenty in vitro a in vivo se snažíme lépe porozumět tomu, jak se proliferativní stádia rybomorek množí v krvi, jak využívají dostupné zdroje a jaké mechanismy využívají k obcházení obranyschopnosti hostitelů. Náš modelový organismus, S. molnari, používá vysoce odvozený cytoplazmatický aktin k unikátnímu typu buněčného pohybu, který má velký význam pro vyhýbání se kontaktu s buňkami imunitního systému hostitele. (Hartigan et al. 2016, Sci Rep 6: 39093). Kromě této motility používá S. molnari k přežití a šíření v hostitelské krvi široký repertoár proteolytických enzymů, z nichž některé jsou exprimovány pouze během proliferace a mají zvláštní význam pro časné šíření parazitární infekce u ryb. V současné době biochemicky charakterizujeme některé proteázy a specifické inhibitory proteáz. Hlavním zdrojem živin pro krevní stádia parazita jsou červené krvinky (Korytar et al. 2020, Parasite Immunol. 42:e12683). Jejich imunitní odpověď a také jejich role v přenosu energie / výživy jsou předmětem dalšího zkoumáni. Souběžně zkoumáme imunologickou reakci kapra na S. molnari, která probíhá v několika fázích; počáteční skrytá infekce charakteristická nízkou úrovní zánětu a aktivací imunitního systému je následována významně protizánětlivou reakcí po uvolnění proliferativních stádií do krevního řečiště. (Korytar et al. 2019, Parasit Vect 12: 208) V dalších experimentech jsme rozšířili dostupné znalosti o kinetice subpopulací leukocytů během infekce a vyhodnotili jejich proliferační kapacitu v hlavních lymfatických orgánech. Tato proliferace vede k významnému zvýšení počtu cirkulujících B lymfocytů produkující specifické protilátky proti S. molnari. Tyto protilátky, vykazující silnou lytickou aktivitu in vitro, nedokáží zabránit množení parazita in vivo, což naznačuje možnou únikovou strategii využívanou parazitem. V současnosti se věnujeme charakterizaci změn v antigenním složení během životního cyklu parazita a jeho dopad na aktivitu a efektorové vlastnosti B lymfocytů.

Umlčování genů a funkční výzkum myxozoí

Navzdory éře sekvenování nové generace jsou techniky reverzní genetiky ve výzkumu myxozoí omezené. Významný krok vpřed k prozkoumání biologických aspektů těchto bezprecedentních parazitů ztělesňuje umlčování genů (gene knockdown) pomocí RNA interference (RNAi). Proto jsme optimalizovali a experimentálně demonstrovali postup pro genový knockdown neobvyklých aktinů (Kyslík et al. 2024) související s unikátním pohybem modelového systému Sphaerospora molnari infikujícího kapra vytvořeného v naší laboratoři pomocí in vivo infekce kapra obecného. V tomto směru můžeme použít tento neocenitelný výzkumný nástroj k prozkoumání dříve neznámých genů specifických pro Myxozoa. Pokračujeme ve zkoumání genů s neznámými funkcemi u myxozoí pomocí RNAi, což značně podporuje odhalení mnoha aspektů této záhadné skupiny parazitů.

PARAZITIČTÍ PRVOCI

Kromě hlavního zaměření na skupinu Myxozoa se věnujeme také poznávání rozsáhlé diverzityparazitických protist z vodního prostředí. Studujeme jejich distribuci, vzájemné interakce, patologii, vztahy s hostiteli, ekologii, ale i funkční a evoluční aspekty. Níže naleznete několik ukázek našich nedávných a stále probíhajících výzkumů.

Výzkum patogenních a amfizoických améb

Náš nejnovější výzkum zahrnuje výzkum patogenů působících vznik améboidního onemocnění žaber (AGD) u atlanstkých lososů severní Evropy. Původcem onemocnění a tedy našim modelovým organismem je Paramoeba perurans. Momentálně testujeme různé druhy látek kvůli jejich účinkům vůči P. perurans a možnostem jejich využití jako lék proti AGDv krmivech. Většina tohoto výzkumu je finančně podpořena společností R&D v rámci Skretting Aquaculture Research Centre. Dále se zabýváme hledáním patogenních améb ve vodních zdrojích ovlivněných lidskou činností za použití molekulárních metod a jsme vlastníky unikátní rozsáhlé sbírky kultur amfizoidních améb z různých vodních stanovišť a hostitelů, čítající stovky různých kmenů. Některé z nich byly nedávno zdokumentovány včetně jejich morfologie, ultrastruktury a molekulární fylogeneze v “Illustrated Guide to Culture Collection of Free-living Amoeboe” publikovaný I. Dykovou a M. Kostkou (2013); Academia (Praha), 363 stran. Neuveden. ISBN 978-80-200-2176-2. Kontaktujte nás prosím pokud máte zájem o další výzkum některého z těchto kmenů.

 

Epicelulární parazité

Different types of epicellular host-parasite complexes

V nedávné době byl naší pracovní skupinou vypracován ucelený přehled způsobů interakcí, mechanismů invazí a metabolických adaptací epicelulárních prvoků kmene Apicomplexa, které napadají studenokrevné hostitele a které jsou velmi málo prostudovanou skupinou parazitů (LINK). Epicelulární apikomplexa vytváří na povrchu střeva hostitele útvary, které se liší morfologií pravděpodobně podle různého způsobu příjmu živin. Spojení hostitel-parazit u epicelulárních apikomplexí je charakterizováno utvářením tzv. “feeder“ organely u kryptosporidií, narozdíl od monopodiálních a hvězdicovitých stádií vyskytujících se u kokcidií. Transkriptomová analýza epicelulární kokcidie Goussia janae odhalila, že RON a AMA proteiny pravděpodobně představují klíčové molekulární nástroje pro tyto parazity k proniknutí do hostitelské buňky. Tento parazit ovládá enzymy příto

mné v téměř celém procesu metabolismu uhlíku, čímž připomíná spíše mnohostranné metabolické schopnosti vnitrobuněčné kokcidie Toxoplasma gondii nežty méně výkonné, typické právě pro epicelulární Cryptosporidium spp. Fylogenetická analýza rDNA dat odhalila, že epicelulární parazitismus se pravděpodobně vyvinul konvergentně jako adaptace na osídlení různých buněčných typů a tkání.

KONTAKT

Biologické centrum AV ČR, v.v.i.
Parazitologický ústav
Branišovská 1160/31
370 05 České Budějovice

NAJÍT PRACOVNÍKA